Clinical Research Insider

La  cuantificación simultánea de biomarcadores de estrés oxidativo en el diagnóstico de la encefalopatía hepática mínima

Una rebanada de queso en la mesa de Sir Andrew Aguecheek

Por: Dra. Ana Villaseñor Todd*

Quién hubiera pensado que los espectaculares atardeceres que pintó Joseph Mallord William Turner fueron plasmados en el romanticismo durante  la hambruna  que desató la erupción del volcán Tambora  en 1815. 

¿Qué tiene que ver esta historia con la obra teatral Twelfth Night escrita en 1605?; Sir Andrew Aguecheek, un noble caballero viejo, simplón, inmaduro, amante de la cerveza, que en la escena 3 del acto l menciona: “I am a great eater of beef, but I believe that does harm to my wit” (me gusta comer mucha carne, pero me parece que eso daña mi espíritu). En esta obra literaria William Shakespeare describe un ejemplo clásico del desarrollo de una encefalopatía hepática por intolerancia a las proteínas(1); además deja en evidencia el complejo sufrimiento del ser humano, frente a la enfermedad hepática crónica (EHC). De cómo la cirrosis manifiesta sus estragos en la cognición social de este grupo de enfermos y sus familiares (2).

Imagen: óleo de Joseph William Turner

La encefalopatía hepática (EH) es un trastorno neuropsiquiátrico y cognitivo que se produce debido a la cirrosis descompensada(3). La EH también se denomina EH “manifiesta”, es una complicación frecuente en los pacientes con cirrosis que reduce la calidad de vida, al tiempo que aumenta la mortalidad en este grupo de enfermos. 

La encefalopatía hepática mínima (EHM)  se presenta en al menos 50% de los pacientes con cirrosis(4) y aumenta el riesgo de progresión a EH(5)(6). La EHM se define como una afección caracterizada por anomalías sutiles que pueden pasar inadvertidas durante la consulta médica y que son reversibles.  El Dr. Bajal describe en el modelo SONIC (Spectrum of Neuro‐cognitive Impairment in Cirrhosis) (7) el deterioro neurológico como parte natural de la enfermedad hepática crónica. Inicia en un estado neurológico normal, pasando por la degeneración neuronal, hasta el coma y la muerte del individuo con EHC. 

Para prevenir el desarrollo de EH, la intervención temprana para la EHM basada en un diagnóstico preciso es fundamental. Los pacientes con EHM tienen reducción del desempeño en las actividades diarias, por lo que presentan una vida productiva más corta, tienen déficits de atención, memoria, velocidad de respuesta y coordinación visuo-motora. Actualmente no existe un estándar de oro para hacer diagnóstico de EHM(4). La EHM puede detectarse utilizando una combinación de pruebas neuropsicométricas y/o neurofisiológicas específicas en pacientes con EHC(8), lo que consume mucho tiempo en la práctica clínica por la necesidad de la adaptación de las pruebas según la edad y la escolaridad  del paciente, además de requerir personal experto y la necesidad de disponer de equipos costosos. Ello resulta en que la mayoría de los pacientes con EHM permanecen sin diagnóstico y consecuentemente sin un tratamiento oportuno, repercutiendo directamente en la calidad de vida y en la sobrevida de los pacientes con cirrosis. 

Se  han identificado alteraciones metabólicas en el cerebro de pacientes con EHM.  Reportes  Montoliu y cols. evaluaron los niveles séricos de diferentes metabolitos de estrés nitro-oxidativo, el monofosfato cíclico de guanosina (cGMP), nitritos + nitratos y 3-nitrotirosina (3-NO-Tyr); A pesar de que 3-NO-Tyr ha sido evaluada en EHM, existe una amplia variación de resultados que  respaldan su utilidad clínica, debido principalmente a los métodos de cuantificación, lo que ha desestimado el uso de la 3-NO-Tyr con fines diagnósticos. 

La 3-NO-Tyr es el producto de la nitración de la tirosina (Tyr). La palabra “tirosina” proviene del griego tyrós, que significa queso, descubierta por primera vez en 1846 por el químico alemán Justus von Liebig, quien a sus 13 años fue inspirado por los mismos atardeceres plasmados durante la erupción volcánica más mortífera de la historia en 1816, año que dejó a Europa sin verano. Sin embargo, las cosechas arruinadas motivaron a Liebig a realizar verdaderas aportaciones científicas a la nutrición e inventar su peculiar comida soluble para bebés. Gracias a las innumerables aportaciones de Liebig, al realizar la descripción de la proteína caseína del queso y gran parte de las vías metabólicas de la Tyr es que hoy en día se ha  encontrado que los niveles de 3-NO-Tyr están aumentados de modo significativo en sangre de los pacientes cirróticos con EHM comparados con los niveles de los pacientes sin EHM.

Los mecanismos que conducen a esta alteración en los niveles de 3-NO-Tyr en pacientes con EHM no se conocen por el momento. Para la determinación de 3-NO-Tyr se ha utilizado la técnica de cromatografía líquida en fase reversa (HPLC) para separarla, y se ha detectado posteriormente por fluorescencia. Igualmente se podría localizar con un detector electroquímico después de su separación por HPLC o mediante otros procedimientos. Sin embargo, su variabilidad en los parámetros y métodos de cuantificación (cromatografía de gases y espectrometría de masas), o incluso por medio de un ensayo de ELISA utilizando anticuerpos específicos contra 3-NO-Tyr ha desestimado la utilidad diagnóstica de la 3-NO-Tyr.  

La oxidación de Tyr con cloro puede ocurrir por sustitución electrófila aromática y N-cloración.  En la generación de daño hepático generado por un proceso infeccioso la Tyrosina se degrada en 3-clorotirosina  (Cl-Tyr). La Cl-Tyr ha sido ampliamente estudiada como un biomarcador para la inflamación y el daño oxidativo del tejido resultante de la mieloperoxidasa de neutrófilos en casos de enfermedad inflamatoria crónica. Específicamente, los niveles elevados de Cl-Tyr se han relacionado con insuficiencia renal, aterosclerosis, infarto de miocardio  y fibrosis quística(9).

Para prevenir el desarrollo de encefalopatía hepática manifiesta, la intervención temprana para la encefalopatía hepática mínima (EHM) basada en un diagnóstico preciso es esencial.  Por lo que desarrollamos un método analítico para cuantificar simultáneamente los productos de estrés nitro-oxidativo 3-NO-Tyr y 3-cloro-Tirosina (3-Cl-Tyr) de alta sensibilidad y especificidad para cuantificar los niveles de estos metabolitos en muestras de sujetos participantes con daño hepático y MHE y comparar con los niveles de sujetos con daño hepático sin MHE, así como el nivel basal en sujetos de control sanos. Con la finalidad de evitar la variabilidad en la cuantificación dictamos a la determinación simultánea mediante espectrometría de masas de triple cuadrupolo acoplada a un sistema de cromatografía líquida de ultra alta eficiencia (UPLC-MS / MS XEVO TqD Waters)(10). El espectrómetro se programó utilizando las transiciones moleculares específicas para cada metabolito y el uso de un estándar interno. Las muestras se hidrolizaron antes de su procesamiento y análisis para cuantificar los metabolitos libres y derivados de proteínas.

Los resultados se muestran prometedores por que, mediante el método desarrollado, es posible realizar la cuantificación simultánea de 3-NO-Tyr y Cl-Tyr libres y derivados proteicos, por lo que se puede utilizar para cuantificarlos en muestras de pacientes con cirrosis con EHM, sin EHM y sujetos control.

Por lo anterior es posible cuantificar de manera precisa las concentraciones de ambos metabolitos en la matriz biológica propuesta, por lo que, si presentan diferencias entre los grupos de estudio, se podrían utilizar para determinarlas en el diagnóstico precoz de EHM. 

Dra. Ana Villaseñor Todd 

Científica mexicana destacada por sus estudios en investigación en encefalopatía hepática mínima, estrés oxidativo, calidad de vida y cognición social. Médica de profesión, complementó sus estudios de posgrado en la Universidad de Texas A&M; actualmente es candidata a recibir el grado de doctor en medicina por la UANL.

Comité Técnico:

Francisco Javier Bosques-Padilla, PhD. José Ascención Hernández-Hernández, PhD. Rosa del Carmen López-Sánchez,  PhD. Candidato PhD Carlos Alejandro Cortez-Hernández.

Referencias

1. Guillén JCQ, Soria IC, Montes JMG, Sáenz MJ, Gutiérrez JMH. La encefalopatía hepática: terminología, etiología y tratamiento. 2003;(5):127–34. 

2. Bajaj J. Minimal hepatic encephalopathy matters in daily life. World J Gastroenterol. 2008;14(23):3609–15. 

3. Nardone R, Taylor AC, Höller Y, Brigo F, Lochner P, Trinka E. Minimal hepatic encephalopathy: A review. Neurosci Res [Internet]. 2016;111:1–12. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.neures.2016.04.009

4. Jesús Maldonado-Garza H, Vázquez-Elizondo G, Obed Gaytán-Torres J, Ricardo Flores-Rendón Á, Graciela Cárdenas-Sandoval M, Javier Bosques-Padilla F. Prevalence of minimal hepatic encephalopathy in cirrhotic patients. Ann Hepatol [Internet]. 2011;10:S40–4. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S1665-2681(19)31605-9

5. Kachaamy T, Bajaj JS. Diet and cognition in chronic liver disease. Curr Opin Gastroenterol. 2011;27(2):174–9. 

6. Labenz C, Baron JS, Toenges G, Schattenberg JM, Nagel M, Sprinzl MF, et al. Prospective evaluation of the impact of covert hepatic encephalopathy on quality of life and sleep in cirrhotic patients. Aliment Pharmacol Ther. 2018;48(3):313–21. 

7. Bajaj JS, Cordoba J, Mullen KD, Amodio P, Shawcross DL, Butterworth RF, et al. Review article: The design of clinical trials in hepatic encephalopathy – An International Society for Hepatic Encephalopathy and Nitrogen Metabolism (ISHEN) consensus statement. Aliment Pharmacol Ther. 2011;33(7):739–47. 

8. Ridola L, Cardinale V, Riggio O. The burden of minimal hepatic encephalopathy: From diagnosis to therapeutic strategies. Ann Gastroenterol. 2018;31(2):151–64. 

9. Crow BS, Quiñones-González J, Pantazides BG, Perez JW, Winkeljohn WR, Garton JW, et al. Simultaneous measurement of 3-chlorotyrosine and 3,5-dichlorotyrosine in whole blood, serum and plasma by isotope dilution HPLC-MS-MS. J Anal Toxicol. 2016;40(4):264–71. 

10. Villaseñor Todd A, Hernández-Hernández JA, López-Sanchez RC, Bosques-Padilla FJ, Cortez-Hernandez CA, Lopez Soriano E. Development of the analytical method for the quantification of 3-nitrotirosin and 3-chlorothyrosin in human plasma as potential biomarkers to evaluate minimal liver encephalopathy (MHE). Ann Hepatol. 2020;19(2020):21. 

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